Antikörper

Das Immunsystem bildet Antikörper, wenn

– natürliche (z.B. bakterielle, virale usw.)

– künstliche (z.B. Impfstoffe) oder

– körpereigene (z.B. Autoimmunkrankheiten) Makromoleküle als fremd erkannt und im weiteren als Antigen behandelt werden.

Synthese und Sekretion der Antikörper werden durch die Zellen des Immunsystems rguliert (Makrophagen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten).



Über komplizierte feed-back-Mechanismen entstehen Antikörperpopulationen einer bestimmten

– Spezifität (definiert durch die antigenen Epitope der als fremd erkannten Makromoleküle)

– Affinität (Maß für die Intensität der Reaktion des Antikörpers mit dem Antigen)

– Immunglobulinklasse (definiert nach Anzahl und Struktur der Untereinheiten des Ig-Moleküls als IgG, IgM, IgA, IgE, IgD)

Lokalisation (Serumantikörper, Schleimhautantikörper)

Antigen-Antikörper-Reaktion und serologische Testverfahren

Jedes Verfahren der Serodiagnostik beinhaltet die quantitative Erfassung ("Sichtbarmachung") und Quantifizierung einer Antigen-Antikörper-Reaktion.

Dabei reagiert der im Patientenserum gesuchte Antikörper mit dem im Test eingesetzten bekannten diagnostischen Antigen.

Entsprechend den physikochemischen Abläufen jeder Antigen-Antikörper- Reaktion (Ag-Ak-Reaktion) unterscheidet man serodiagnostische Verfahren grundlegend in



– primäre Tests (Prototypen diser Tests sind die sog. "binding-assays" (Radioimmunassay, RAI und Enzymimmunassay, EIA, ELISA)



– sekundäre Tests (Präziptations-Reaktionen, Agglutinierende Antikörper, neutralisierende Antikörper, hämagglutinationshemmende Antikörper, komplementbindende Antikörper)



Die indirekte Immun-Fluoreszenztechnik (IFT) nimmt eine Zwischenstellung ein



Wichtiger Hinweis:

Die Serodiagnostik von Infektionen erfordert häufig die Durchführung mehrerer serologischer Verfahren unterschiedlicher Testprinzipien.



Unterschiedliche Testprinzipien (primär/sekundär) und unterschiedliche Testmethoden können am selben Patientenserum zu abweichenden Resultaten führen.





Überblick über serologische Testverfahren



– Agglutinationsreaktionen (Nachweis agglutinierender Antikörper, Widal-Test)

– Enzym-Immunoassay (EIA), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

– Hämagglutinations-Hemmtest (HHT)

– Immunoblot (Western-Blot)

– Indirekte Hämagglutination (Passive Hämagglutination)

– Indirekte Immunfluoreszenz Technik (IFT) (indirekte Fluoreszenz Antikörpertechnik, IFAT)

– Kompementbindungsreaktion (KBR)

– Lysis-Reaktionen

– Neutralisations-Reaktionen (Virusneutralisation: NT; Toxin-Neutralisationstests)

– Präzipitations- und Flockungsreaktionen

– Radioimmunassay (RIA)

Agglutinationsreaktionen (Nachweis agglutinierender Antikörper, Widal-Test)



Prinzip

– Agglutination von Erregern (Bakterien, Parasiten) durch Serumantikörper

– Nachweis von Antigen-Antikörperkomplexen (Agglutinate) visuell mit bloßem Auge oder mikroskopisch

– Ergebnisangabe in Titerstufen

Anwendung/wichtigste Indikationen

– Nachweis von Serumantikörpern gegen Antigene von Salmonellen

– Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis

– Listeria monozytogenes, Francisella tularensis

– Brucella abortus ("Langsam-Agglutination")

– Leptospirose (Mikroagglutination)

– Toxoplasmose

– Rickettsiosen

Charakteristika/wichtige Testparameter

– relativ unempfindliches verfahren (Nachweisgrenze um den Faktor 1000 niedriger als ELISA/RIA

– geringe Störanfälligkeit

– Testdauer 1 Stunde (Objektträgeragglutination); 18 - 24 Stunden (Röhrchen-Agglutination)

Interpretation

– Hohe Einzeltiter geben Hinweis auf infektion

– aufgrund von Kreuzreaktionen wegen der Verwendung von korpuskulärer Gesamtzellantigene jedoch Nachweis einer Serokonversion (Titer-Anstieg um 2 Stufen innerhalb von 7 - 14 Tagen) notwendig





Enzym-Immunoassay (EIA), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)



Prinzip

– primärer Multi-Antikörper-Test

– Heterogener Enzym-Immunassay, bei dem die gegen das zu bestimmende Antigen gerichteten spezifischen Antikörper (bzw. bei Antikörperbestimmung homologes Testantigen) an eine Trägersubstanz (z.B. Zellulose, Polystyrol) gebunden vorliegen.

– An die nach Inkubation mit der Probe gebildeten Immunkomplexe lagern sich in einem nachfolgenden Schritt zugefügte, mit einem enzym markierte Antikörper an.

– Durch Zugabe eines chromogenen Substrats zum Reaktionsansatz können die Immunkomplex-gebundenen Enzym-Substrat-Komplexe sichtbar gemacht bzw. die Antigenkonzentration in der Probe über eine photometrische Bestimmung der immunkomplex-gebundenen Markerenzyme durch Vergleich mit Standards bekannter Enzymaktivität ermittelt werden.

Indikationen/Anwendung

– Anwendung bei nahezu allen Infektionskrankheiten möglich

– abhängig von der Verfügbarkeit geeigneter Antigene

Testparameter

– sehr hohe Empfindlichkeit

– gute Standardisierbarkeit

– hoher Automatisierungsgrad

– Dauer der Durchführung i.d.R. 4 - 6 Stunden

– stufenlose Messung

– Angabe der Resultate in "ELISA"-Einheiten oder in Internationalen Einheiten (falls internationale Standardseren vorhanden sind z.B. Toxoplasmose, Röteln, Tetanus, Diphterie-Antitoxin))

Interpretation

– hochpositive Messwerte sprechen für floride Infektion

– dennoch ist im IgG-ELISA der Nachweis einer Serokonversion (signifikanter Anstieg) zu fordern

– Nachweis von spezifischen Serum IgA oft beweisend für eine akute Infektion

– Nachweis spezifischer IgM i.d.R. beweisend für akute Infektion (cave: Persistenz von IgM bei Toxoplasmose und Röteln)

– Cave: falsch positive IgM-Befunde im indirekten ELISA durch Seren mit Rheumafaktor bei unzureichender Absorption







Hämagglutinations-Hemmtest (HHT)



Prinzip

– Nachweis von Serumantikörpern, welche die hämagglutinierenden Eigenschaften verschiedener Virusarten unterdrücken

– Ausbleiben einer Hämagglutination im virusspezifischen Testsystem bei Vorhandensein der gesuchten Antikörper im Patientenserum

– Durchführung i.d.R. in Mikrotiterplatten

Indikationen/Anwendung

– Serodiagnostik von Virusinfektionen, die durch hämagglutinierende Viren verursacht werden (z.B. Röteln, Masern, Influenza)

Testparameter

– relativ störungsanfällige Tests

– Aussagekraft im Hinblick auf bestehende Immunität/Schutz hoch

– Angabe in Titern

– Testdauer 2 - 3 Stunden

Interpretation

– hohe Einzeltiter bei entsprechender klinischer Symptomatik können beweisend sein

– i.d.R. Nachweis einer Serokonversion erforderlich





Immunoblot (Western-Blot)



Prinzip

– Nachweis von erregerspezifischen Serumantikörpern durch Bindung an membrangebundene Erreger-Antigene und nachfolgende Sichtbarmachung mittels enzymmarkierten Anti-Human-Immunglobulins (Anti-IgG, Anti-IgM, Anti-IgA)

– die Besonderheit jedes Immunoblots liegt in der Art und Menge der an die Membran gebundenen Antigene

– typischerweise werden Erregerproteine in einer Polyacrylamid-Elektrophorese nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt und anschließend im Elektro-Blot-Verfahren auf nitrocellulose-Membranen übertragen

Indikationen/Anwendung

– meist als Bestätigungs-Tests vorhergehender Suchtests (ELISA)

– HIV-Serologie

– Lyme-Borreliose

– Yersiniose (Yersinia enterocolitica)

Testparameter

– hohe Spezifität, weil antikörper gegen Einzelproteine erkannt werden können

– Dauer der Durchführung 2 - 4 Stunden

Interpretation

– entsprechend der Testart z.B. "Nachweis virusspezifischer Banden" i.d.R. mit beweisendem Charakter





Indirekte Hämagglutination (Passive Hämagglutination)



Prinzip

– Bindung des diagnostischen Antigens an vorbehandelte oder nicht vorbehandelte Erythrozyten

– Agglutination der Erythrozyten bei Hinzutreten des spezifischen Serumantikörpers

– Durchführung in Mikrotiterplatten



Passive-Partikel-Agglutination:

– Anstelle von Erythrozyten können auch andere Trägerpartike (z.B. Latex) zur Antigenbindung eingesetzt werden

Indikationen/Anwendung

– bei zahlreichen Infektionen/Infektionskrankheiten

– Lues-Diagnostik

– Serodiagnostik der Candidiasis

– Toxoplasmose-Diagnostik

– Anwendung der passiven-Partikel-Agglutination z.B. als orientierender Schnelltest zur Prüfung des Immunstatus bei VZV (Varizella-Zoster-Virus) in der Schwangerschaft, Röteln, EBV (Epstein-Barr-Virus)

Testparameter

– schnelle, einfache Durchführbarkeit, sofern antigenbeladene Erythrozyten als Reagens vorliegen

– hohe Spezifität

– hohe Sensitivität (ca. 100fach niedriger als ELISA, aber 10fach höher als KBR)

– sichtbare Agglutination durch Hinzutreten der homologen Serumantikörper in wenigen Minuten

Interpretation

– hohe Einzeltiter können für floride Infektion beweisend sein

– Angabe in Titern

– i.d.R. ist jedoch der Nachweis einer Serokonversion zu fordern





Indirekte Immunfluoreszenz Technik (IFT) (indirekte Fluoreszenz Antikörpertechnik, IFAT)



Prinzip

– an das Antigen, das an eine Festphase (z.B. ganze Erreger, infizierte Zellen) gebunden ist, bindet sich der im Patientenserum gesuchte Antikörper

– an den entstandenen Ag-Ak-Komplex bindet sich ein fluorochrommarkiertes (Fluorescin-Isothiocyanat) Anti-Human-IgG (-IgM, -IgA)

– im Fluoeszenzmikroskop werden die Ag-Ak-Komplexe als fluoreszierende Strukturen an der Oberfläche der Zellen sichtbar

Indikationen/Anwendung

– häufig angewendetes serodiagnostisches Verfahren

– häufigste Indikationen in der Toxoplasmose-Diagnostik

– Lues-Diagnostik

– Lyme-Borreliose-Diagnostik

– Bestätigungstest in der HIV-Diagnostik

Testparameter

– schlechtere Reproduzierbarkeit durch subjektive Auswertung - je nach Testart - unspezifische fluoreszenz

– schnelle Durchführbarkeit (1 - 2 Stunden)

– Gefahr der Rheumafaktor-Interferenz bei IgM-Tests (vorherige Absorption bei IgM-Tests notwendig)

Interpretation

– hohe Einzeltiter können für floride Infektion beweisend sein (z.B. Toxoplasmose), jedoch Serokonversion zu fordern

– Angabe derergebnisse in Titern





Kompementbindungsreaktion (KBR)



Prinzip

– Sekundärer Test

– indirekter Antikörpernachweis, der sich die Änderung der Fc-Anteile von Antikörpern der Klassen IgG und IgM (nicht aber IgA!) zunutze macht, durch die in Gegenwart von Ca++ - und Mg++ - Ionen die Komplementkaskade aktiviert und Komplement verbraucht wird

– Indikatorsystem (Schaferythrozyten und Antikörper gegen Schaferythrozyten vom Kaninchen) zeigt den Komplementverbrauch (und damit das Vorhandensein komplementbindender Serumantikörper) an

Indikationen/Anwendung

– in der Vergangenheit universell eingesetztes Verfahren ("Wassermann"-Test bei Lues)

– jetzt meist ergänzend eingesetzt bei ausgewählten Indikationen:

– CMV-Infektion

– Mykoplasma-Infektionen

– Toxoplasmose

– Poliomyelitis

– Brucellose

– Listeriose

Testparameter

– gut standardisierbare Testbedingungen

– gute Reproduzierbarkeit

– Spezifität abhängig von derQualität der eingesetzten Antigene

– keine differenzierung zwischen IgG- und IgM-Antwort

– geringe Sensitivität (1000fach niedriger als ELISA, aber 5fach höhert als Agglutinationsreaktion/Widal)

Interpretation

– hohe KBR-Titer i.d.R. beweisend für floride Infektion, z.B. der Zytomegalie oder einer Mykoplasmen-Pneumonie (wegen der relativ geringen Sensitivität der Methode)

– i.d.R. Serokonversion zu fordern

– nicht geeignet zur Frühdiagnostik





Lysis-Reaktionen



Prinzip

– Messung der antikörperabhängigen Auflösung partikulärer Antigene unter Teilnahme von Kofaktoren, meist Komplement

– Durchführung z.B. als komplementabhängige Bakteriolyse oder komplementabhängige Hämolyse

Indikationen/Anwendung

– HIG (Hämolyse-in-Gel-Test): Nachweis von Röteln-Serumantikörpern der Klasse IgG

– TPI (Treponema-Pallidum-Immobilisationstest): Antikörper von Lues-Patienten, die in Gegenwart von Komplement und Lysozym lebende Test-Treponemen (aus Kaninchenhoden) zunächst immobilisieren und dann auflösen

Testparameter

– HIG: einfach durchzuführender, ergänzender Test in der Serodiagnostik der Röteln

– TPI: aufwendig, Speziallaboratorien vorbehalten, in der Routinediagnostik überflüssig

Interpretation

– positiv/negativ-Befundung zu bestehender Röteln-Immunität





Neutralisations-Reaktionen (Virusneutralisation: NT; Toxin-Neutralisationstests)



Prinzip

– Antikörper im Patientenserum verhindern:

• den zytopathischen Effekt eines Virus im antikörperfreien Milieu in der Zellkultur (Virus-Neutralisation, Neutralisationstest:NT)

• den zytopathischen Effekt eines bakteriellen Toxins im antikörperfreien Milieu in der Zellkultur (Diphterie-NT)

• die biologische Wirkung eines bakteriellen Toxins (z.B. Hämolyse, DNA-Abbau, Hyaluronsäure-Abbau) oder eines viralen Enzyms (z.B. neuraminidase der Influenzaviren)

• andere Effekte (z.B. Sabin-Feldmann-Farbtest)

Indikationen/Anwendung

– speziellen Fragestellungen vorbehalten (hoher methodischer Aufwand), z.B. Impfstoffprüfung, Polio-Immunität

– Goldstandard beim Nachweis von Diphterie-Antitoxin (Feststellung einer Diphterie-Immunität)

– Nachweis von Antikörpern, die die hämolysierenden Effekte von Streptolysin O von Streptokokken und des Staphylolysins von Staphylokokken hemmen im

• AST (Antistreptolysin-Test)

• STAL (Anti-Staphylolysin-Test)

• Anti-DNAse, Anti-Hyaluronidase-Test

• Neuraminidase-Hemmtest (Immunitätsprüfung nach Influenzaschutzimpfung)

– Sabin-Feldmann-Test (SFT), von der WHO in IU/ml standardisierter IgG-spezifischer Test, beruht auf der durch Antikörper verhinderten Anfärbbarkeit von lebenden Toxoplasmen (mikroskopische Auswertung)

Testparameter

– "golden Standard" für alle Untersuchungen zur Immunität/Immunitätslage (wegen ihrer hohen Spezifität und biologischen Aussage)

– diagnostische Sensitivität jedoch nicht sehr groß

– Toxin-Neutralisations-Tests sind spezifisch, sensitiv und mechanisierbar

Interpretation

– Angabe in Titern oder Units sind i.d.R. nur bei deutlicher Titerbewegung/signifikantem Anstieg klinisch interpretierbar





Präzipitations- und Flockungsreaktionen



Prinzip

– Nachweis von Serumantikörpern (Präzipitinen), die bei Hinzutreten des homologen Antigens lösliche Ag-Ak-Komplexe bilden

– diese Komplexe (Präzipitate) werden sichtbar

• im flüssigen Milieu (Röhrchenpräzipitation)

• im Agarosegel als radiale Immundiffusion (Mancini-Technik)

• zweidimensionale Agargel-Präzipitation (Ouchterlony-Technik)

• Gegenstromelektrophorese

• Immunelektrophorese (Grabar-Technik)



Cardiolipin-Flockungs-Reaktion (VDRL: Venereal Diseases Research Laboratory-Test):

– In Gegenwart von gegen Lipoid-Antigen gerichteten Serumantikörpern (als Antigen dient Cardiolipin aus Rinderherzen) tritt eine Flockung des kristallinen Antigens auf (abgelesen mikroskopisch in der Mikrotiterplatte)

Indikationen/Anwendung

– in der Serodianostik bei ausgewählten Fragestellungen

– z.B. radiale Immundiffusion zum Nachweis von gegen Aspergillus gerichteten Präzipitinen



Cardiolipin-Flockungs-Reaktion:

– einfacher Lues-Suchtest, hohe Sensitivität in der späten Infektionsphase

Testparameter

– hohe Spezifität

– relativ geringe Sensitivität (Mancini-, Ouchterlony-Technik)

Interpretation

– geringe Titerhöhen

– meist qualitativer Nachweis ausreichend





Radioimmunassay (RIA)



Prinzip

– an das an eine feste Phase adsorbierte Antigen bindet sich zunächst der gesuchte Serumantikörper, anschließend Zugabe eines radioaktiv markierten Antigen-spezifischen Serums

– das Ausmaß der noch bindenden Radioaktivität ist umgekehrt proportional zur Menge des gebundenen Serumantikörpers

Indikationen/Anwendung

– wichtig in der Hepatitis-A- und -B- Serologie

– durch ELISA weitgehend abgelöst

Testparameter

– sehr hohe Sensitivität

– Nachteil durch aufwendigen Umgang mit Isotopen

Interpretation

– meist standardisierte Reagenzien (z.B. Hepatitis-B-Serologie)

– Angabe in IE (Internationale Einheiten) mit Bezug zur Immunitätslage